No ano de 2000, José Acasuso chegou a sua primeira final do Challenger em Montevidéu, onde perdeu para Coria, e chegou às semifinais em outros dois torneios.
No ano seguinte, chegou pela primeira vez em sua carreira a uma final da ATP em Buenos Aires, mas perdeu para Kuerten depois de derrotar Gaudio nas semifinais. Nesse mesmo ano, conseguiu seu primeiro título no Challenger em Bermuda.
Em 2002, obteve o primeiro título de sua carreira, terminando o ano entre os 50 melhores, e ajudou seu país a vencer a segunda Corrida dos Campeões da ATP. Superou Moyà e seu conterrâneo Squillari para ganhar seu primeiro título na carreira da ATP em Sopot.
Disputou a World Team Cup, na qual obteve um registro de 2-2, incluindo uma vitória sobre Safin na primeira partida da final, quando o russo se retirou. Chegou às finais do Challenger em Biella, onde perdeu para Hrbaty, e Braunschweig, onde foi derrotado por David Sánchez.
Após obter seu primeiro título em Sopot, aumentou seu número de vitórias para 10, com o título no Challenger de San Marino. Chegou à final da ATP em Bucareste e em Palermo. Acumulou um registro de 22-12 no saibro.
No ano de 2003, seu melhor resultado na ATP foi chegar às semifinais em Bucareste. Foi à final do Challenger de Biella, onde perdeu para Volandri. Obteve uma marca de 8-9 no saibro e 3-8 no cimento.
No ano seguinte, José Acasuso terminou entre os 100 melhores tenistas pela terceira vez em quatro anos, depois de conseguir seu segundo título da ATP em Bucareste e chegar a outra final em Sopot, onde foi superado por Nadal.
Também venceu o primeiro título da ATP de sua carreira em duplas em Umag, jogando com Saretta, e chegou a outras duas finais. Desfrutou do êxito nas quadras de saibro da América Latina, onde foi às semifinais em Buenos Aires, perdendo para Moyà, e Costa do Sauípe, onde foi derrotado por Gustavo Kuerten.
Em 2005, o tenista argentino conseguiu posicionar-se no Top 50 pela segunda vez. Chegou à quarta etapa de Roland Garros, foi pela segunda vez às semifinais da ATP e pela terceira vez às quartas-de-final. Em seus quatro primeiros torneios, conseguiu chegar às quartas-de-final em Auckland e Viña del Mar e às semifinais em Buenos Aires.
Em maio, foi às semifinais em Sant Poelten e manteve-se até a quarta etapa em Roland Garros, onde superou dois sets na segunda etapa para ganhar do número 3 Roddick por 8-6 no quinto. Nessa etapa, foi eliminado por Puerta.
Em agosto, chegou às quartas-de-final em Sopot e no Masters Series de Cincinnati; neste último, foi eliminado por Federer. Sua última atuação da temporada foi chegar às quartas-de-final em Basiléia. Obteve uma marca de 2-4 contra adversários incluídos entre os 10 melhores, com vitórias sobre Safin e Roddick.